宮頸細胞DNA倍體分析檢測宮頸病變的臨床價值

            婦產科在線2022-04-08 11:06:44

              【摘要】目的:探討宮頸細胞DNA倍體分析檢測宮頸上皮內瘤樣變 Ⅱ級及以上病變(以下簡稱CINⅡ+)的臨床價值。方法:同時進行宮頸細胞DNA倍體分析以及細胞學檢查(TCT),且有病理標本的396例病例,對比分析DNA倍體分析、液基細胞學TBS分類方法(也簡稱TCT)診斷CINⅡ+病變的臨床價值。結果:TCT對CINⅡ+敏感度為57.6%,特異度為50.1%;DNA倍體分析對CINⅡ+敏感度為80%,特異度為54.7%;TCT聯合DNA倍體分析對CINⅡ+敏感度為81.3%,特異度為26.8%。結論:DNA倍體分析診斷CINⅡ+病變優于單獨細胞學TBS診斷以及兩種的聯合應用。


            【關鍵詞】

            DNA倍體分析 宮頸篩查 細胞學檢查 宮頸病變


              50年來宮頸癌篩查雖然大大減少了發達國家和發達地區宮頸癌的發病率與死亡率,而在發展中國家以及經濟欠發達等衛生資源缺乏的地區,宮頸癌的發病率與死亡率雖有所減低,但實際上仍比發達國家高許多。據世界衛生組織統計的數據,2008年,在發展中國家,宮頸癌的新發病例則位于第二位[28]。2012年,WHO估計世界范圍內的宮頸癌新發病例為52.8萬,85%發生于經濟欠發達地區,中國新增患者6.20萬[10]。在這些國家和地區,普遍存在著人口基數大、衛生資源缺乏、病理醫生缺乏,尤其是出色的細胞病理學醫生,以及經濟基礎和實力不夠的情況,這些情況無疑放大了細胞學檢查的不標準性、不確定性、不穩定性。由于病理醫師缺乏以及水平低下,一些地區甚至摒棄細胞學檢查,而采用靈敏度較低的宮頸醋酸白染色(VLI)以及宮頸盧戈氏碘染色(VILI)作為宮頸癌的初篩[26,29]。近年來國內外已有報道細胞DNA倍體分析作為新的光電自動檢測法來行宮頸癌癌前評價[1,3~6]。宮頸脫落細胞DNA倍體分析較宮頸細胞的TBS分類診斷用于宮頸癌篩查是否有更高或者相當的靈敏度,能否在三階梯篩查中取代TCT, 實現宮頸癌篩查的自動化、智能化以及標準化是本研究的目的。


              1.對象與方法


              1.1研究對象 選取2013年2月至2013年10月在夷陵婦幼保健院婦科門診及住院接受宮頸癌篩查的942例患者,同時進行宮頸細胞DNA倍體分析和TCT檢查,其中96例因宮頸細胞DNA倍體分析異常、98例因TCT檢查異常、94例因上述兩項檢查均異常行陰道鏡引導下宮頸活檢,進行病理組織學檢查。108例因功能失調性子宮出血或子宮腺肌病或多發子宮肌瘤行全子宮切除術而獲得宮頸病理檢查結果,而DNA倍體分析以及TCT檢查均未提示異常。這四種情況共396例患者中,年齡最大69歲,最小21歲,平均年齡40.32+8.3歲。


              1.2研究方法


              1.2.1取材 常規暴露宮頸,用武漢蘭丁醫學高科技有限公司配套的一次性宮頸細胞采集刷插入宮頸口1-1.5cm,直到采樣器的外部刷毛接觸到宮頸,以順時針方向旋轉5-10周后慢慢取出,收集宮頸口及宮頸管內脫落細胞,將其放入相應的含有固定液的樣本保存管中,下推其刷頭入管,擰緊瓶蓋。


              1.2.2制片、染色 充分振蕩樣本保存管,以減少宮頸脫落細胞在宮頸采樣刷上的黏附,取出宮頸采樣刷。將標本由樣本保存管移至含有30ml固定液的標本收集管中,加入酶消化液,振蕩120min(150次/min),離心5min(800rpm),50%乙醇清洗,離心2次,棄上清液,加固定劑2-3ml,振蕩,混勻,加200ul細胞懸液入細胞離心管,離心、甩片5min,制成液基薄層細胞片2張。1張采用巴氏染色做常規細胞學檢查,另1張采用Feulgen染色進行DNA倍體分析。


              1.2.3檢測方法 DNA倍體分析使用LD DNA-ICM系統進行分析,后者由奧林巴斯BX41顯微鏡、浪潮NP370D2服務器、自動控制平臺以及控制系統、ueyeM2240攝像頭以及相應的輔助配件組成。在軟件方面安裝了武漢蘭丁醫學高科技有限公司自行研制的細胞圖像分析軟件。操作人員為一般的技術人員。細胞學檢查由具有資質的病理醫生閱片,采用TBS系統對結果進行分級判斷,細胞學結果異常的需經病理主任醫師確認。


              1.2.4陰道鏡檢查及病理學檢查 凡是宮頸常規細胞學檢查結果為未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細胞(ASCUS)及以上,包括ASCUS、低級別鱗狀上皮內病變(LSIL)、高級別鱗狀上皮內病變(HSIL)、不排除高級別鱗狀上皮內病變的ASCUS (ASC-H)、不典型腺細胞(AGC)、鱗癌、腺癌,均認為細胞學檢查結果異常;當細胞DNA值>5時,即可認為是DNA異倍體細胞,DNA倍體分析結果可分為未見DNA異倍體細胞、見少量DNA異倍體細胞(有1~2個異倍體細胞)、 可見DNA異倍體細胞(有3~14個異倍體細胞)、大量DNA異倍體細胞(有異倍體細胞15個及以上)。凡DNA倍體分析提示有DNA倍體異常細胞,均認為DNA倍體分析檢查結果異常。兩項檢查有一結果異常,則行陰道鏡檢查并多點活檢。部分病例雖然上述檢查未提示異常,但是肉眼觀察宮頸顆粒樣外觀、網格狀血管走行等情況下,也行陰道鏡引導下的宮頸活檢。病理診斷分為無病變組(NILM, 包括慢性宮頸炎伴或不伴鱗狀上皮增生、濕疣樣改變、乳頭狀糜爛及息肉樣增生等改變)、CINI(包括CINI累腺)、CIN II(包括CINI~II級、CIN II級、以及兩者的累腺情況)、CIN III級(包括CIN II ~ III級、CIN III 級、以及兩者的累腺情況)、宮頸癌(原位癌、鱗癌、腺癌、腺鱗癌等)。


              1.3統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件進行統計學處理。


              2.結果


              2.1 DNA倍體分析結果與宮頸活檢組織病理學診斷的關系 有一例因上皮細胞過少,DNA無法判讀,故行陰道鏡引導下宮頸組織活檢的396例病例中只有395個DNA倍體的分析報告。35例為CIN II+ 病變,其中28例DNA倍體分析結果提示為異常。結果見表1。



              對DNA倍體分析與病理診斷結果做Spearman等級相關的SPSS計算結果顯示:相關系數rs=0.374>0,P=0.000<0.01,相關系數rs有統計學意義。即隨著dna倍體分析級別的升高,病理診斷異常的可能也有逐漸提高的趨勢。見表2及圖1。





            圖1:DNA異倍體分析與病理診斷結果為CIN II+ 之間的關系


              2.2 TCT結果與宮頸活檢組織病理學診斷的關系 因血液成分過多TCT結果無法判讀,故396例中只有380個細胞學檢查報告。在CIN II+ 病變中,TCT結果異常的有21例。結果見表2。隨著TBS診斷級別的升高,病理診斷CIN II+ 的比例總體是不斷增加的,但是細胞學檢查結果為NILM與ASCUS的患者,其病理診斷CIN II+ 的比例并無明顯區別(7.45% VS 6.89%)。見表3,圖2。





            圖2:TBS診斷與病理診斷結果為CIN II+ 之間的關系


              對TBS診斷與病理診斷結果做Spearman等級相關的SPSS計算結果顯示:相關系數rs=0.136>0,P=0.000<0.01,相關系數rs有統計學意義。即隨著tbs診斷級別的升高,病理診斷異常的可能也有逐漸提高的趨勢。< span="">


              2.3 DNA倍體分析結果與宮頸細胞學檢查結果比較 隨著細胞學檢查結果級別的升高,DNA異倍體細胞的比例也不斷升高。在細胞學結果為ASCUS中,有DNA異倍體細胞的比例為46.82%,而在細胞學結果為HSIL中,存在DNA異倍體細胞的比例高達100%。兩者的關系見圖3。



            圖3:宮頸細胞學檢查與DNA倍體分析結果的關系


              分別取細胞學檢查結果為ASCUS+為細胞學檢查陽性、查見異倍體細胞即為DNA倍體分析陽性,對此兩種檢測方法做配對卡方檢驗,McNemar's Test 的結果為:P=0.659>0.05(Excat Sig(2-sided)),兩種方法診斷結果差異無統計學意義。


              2.4兩種宮頸癌篩查方法診斷試驗的評價結果 TCT診斷CINⅡ+(宮頸高度病變及宮頸癌)的敏感度為57.6%,準確度為50.8%;DNA倍體分析診斷CINⅡ+的敏感度為80%,準確度為56.9%。詳見表4。




            圖4:DNA倍體分析與細胞學檢查以及兩者聯合診斷CINⅡ+病變的ROC曲線


              圖4為DNA倍體分析、細胞學TBS診斷以及兩種方法聯合診斷CINⅡ+病變的ROC曲線,三者的曲線下面積分別為0.769、0.580、0.732結果提示,DNA倍體分析診斷CINⅡ+病變優于單獨細胞學TBS診斷以及兩種的聯合應用。


            3.討 論

              

              細胞DNA定量分析技術主要通過對細胞核內DNA含量或倍體的測定來判斷細胞的生理狀態和病理改變。目前主要是使用全自動DNA圖像分析系統(DNA-ICM)。定量分析細胞DNA具有如下特點[30]:①檢測細胞核內的相對DNA含量,而不是絕對值。常用c(content)作為單位來衡量DNA的含量。1個c為正常G0/G1細胞DNA含量的一半。②Feulgen染色使DNA特異性著色。其染色的深淺與DNA的含量成正比。③通過測量光密度(灰階)計算被測細胞細胞核的積分光密度值(IOD, integrated optical density)。④用DNA指數來表示DNA含量。DNA指數=被測細胞DNA IOD值/正常細胞DNA IOD平均值。⑤由于淋巴細胞內DNA含量及形態較為穩定,細胞DNA倍體分析時常用同一標本的淋巴細胞作為標準對照。⑤分析每個細胞的DNA含量,并用DNA直方圖,散點圖顯示標本惡性度。按細胞DNA含量高低,由高到低自動排序,將核酸含量高的前20個細胞核酸含量值直接報告,高于正常值為癌變細胞。(如圖5)。



            圖5:細胞DNA倍體分析報告圖


              宮頸細胞的惡變由胞核染色質首先改變,高危型HPV的DNA整合到宮頸細胞核DNA上,病毒蛋白E6/E7分別通過與抑癌蛋白P53、RB相作用,干擾中心體合成,紡錘絲缺陷,出現異倍體細胞核,最終才發展到晚期癌變細胞。這是細胞DNA定量分析技術可用于宮頸癌篩查的理論依據,也是全自動DNA圖像分析系統在診斷CIN病變有可能較常規細胞學敏感的理論基礎。

              1924年Feulgen和Rossenbcek發現了細胞核內DNA染色技術后[25],使得這一理論轉為實際應用。這一技術才得以開展、應用于實驗室及臨床。早在2004年,The European

            Society of the Analytical Cellular Pathology 就對DNA倍體分析適用于輔助診斷宮頸病變達成共識[11]。近十多年,不斷有DNA倍體分析技術用于臨床的報到[2,5,12-15,19],在婦產科,多限于對宮頸癌及癌前病變的DNA倍體分析[1,7,8,12,22],而用于宮頸癌普查則報道的較少[3,6,21]。


              本研究結果顯示,隨著細胞學檢查結果級別的升高,DNA異倍體細胞的比例也不斷升高,與Nguyen VQ 等[[8]研究結果相似,同時,隨著DNA倍體分析級別的升高,病理診斷異常的可能也有逐漸提高的趨勢。此外,相對于單項篩查,宮頸細胞DNA倍體分析檢測出CINⅡ+病變的敏感性要高于細胞學的TBS診斷(80% VS 57.6%),兩者的特異度差別不大(54.7% VS 50.1%)。就篩查方案而言,DNA倍體分析診斷CINⅡ+病變優于單獨細胞學TBS診斷以及兩種的聯合應用。


              當然,宮頸細胞DNA倍體分析也有其不足之處[30]。目前宮頸癌的趨勢之一腺癌的比例,而腺癌細胞比起鱗癌細胞,更容易重疊,聚集成團,造成一定程度的分割困難,DNA圖像分析系統極易將這類細胞視為垃圾細胞,不能做出診斷,增加了誤診和漏診率。此外,維生素B12缺乏、放療、化療、HPV病毒感染等因素均可能影響DNA含量的測定,目前實際所測得的數據并不能將這些影響因素加以區分。


              雖然現已明確,高危型HPV感染是95%以上宮頸癌的明確病因,但是HPV感染不能機械地等同于腫瘤進展,在婦女一生中高達80%的人會感染HPV, 其中90%的HPV DNA 可在2年后轉陰,這是HPV感染最常見的結局。只有不到10%的感染會持續存在,但這其中也只有少部分高危型HPV持續感染可能引發宮頸病變或者宮頸癌。這也是不提倡單獨將高危型HPV檢測作為宮頸癌篩查的主要原因。美國癌癥協會、美國陰道鏡和宮頸病理學會(ASCCP),和美國臨床病理學會(ASCP)新近更新的宮頸癌篩查的聯合指南強調的是細胞學的篩查或者是細胞學聯合高危型的HPV篩查。新近的研究也支持聯合篩查[17.20.23],雖然液基細胞學檢查為目前主流的細胞學篩查方法,但不同國家、地區因經濟情況、細胞病理醫師水平、工作量不對等原因,無法徹底改變液基細胞學檢查不標準性、不確定性、不穩定性的“三不”缺憾。DNA倍體分析也是針對宮頸細胞的檢測,且核酸的改變早于細胞形態學的改變,這也是DNA倍體分析敏感度較液基細胞學檢查高的可能原因。此外,相較于TCT,DNA倍體分析自動化程度高、更經濟實用。在部分文獻中[20.3.21],推薦將DNA倍體分析或者DNA倍體分析聯合高危型HPV檢測作為宮頸癌的一線篩查。本研究的結果也支持DNA倍體分析用于宮頸癌的一線篩查。在今后的研究中, 將進一步比較此兩者種針對宮頸細胞的檢查聯合針對宮頸癌病因的高危型HPV檢查各種篩查方案的優劣。



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